Молекулярна діагностика: ПЛР в реальному часі

В даний час в молекулярній діагностиці розроблено механізм полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що стало поштовхом для розвитку великої кількості методів діагностики захворювань, заснованих на визначенні генетичного матеріалу. Для проведення ПЛР в реальному часі використовується фрагмент гена (зокрема нуклеїнової кислоти) збудника захворювання, який не зустрічається у інших особин.

Принцип ПЛР полягає в розмноженні певного фрагмента ДНК збудника в мільйони разів за допомогою ДНК-полімерази в спеціальному апараті, іменованому термоциклер, який забезпечує циклічне повторення температурного режиму за заданою програмою.

Діагностика ПЛР дає можливість повторювати ряд ампліфікації, зберігаючи активність ферменту. Коли ампліфікація проходить безперешкодно, за один цикл кількість копій певної ділянки ДНК збудника зростає вдвічі, після тридцяти циклів - в сто десять разів. Саме тому ПЛР використовується в діагностиці для визначення досить маленьких патогенних організмів, виявлення яких без цього неможливо.

Слід зазначити, що РНК не може бути матрицею для ПЛР в реальному часі. Тому, для того, щоб виявити вірусну РНК, перед ампліфікацією потрібно отримати ДНК, що співвідносяться з відповідним її фрагментом. Полімеразна ланцюгова реакція дає можливість проводити вимірювання ДНК і РНК збудника. Отримана таким чином інформація використовується для проведення спостереження за ефективністю використовуваної терапії, а також оцінки клінічного прогнозу.

Крім того, ПЛР в реальному часі не потребує додаткових діях щодо розшифровки досліджуваної ДНК або амплікон, які служать бар`єром для постановки правильного діагнозу і призводять до отримання помилкових результатів. Даний підхід дозволяє не використовувати стадію електрофорезу, що веде до зниження ризику зараження продуктами полімеразної ланцюгової реакції. Також, у зв`язку зі зменшенням кількості проведених маніпуляцій зі збудником, скорочується час проведення дослідження, спрощується його процес, знижується ймовірність виникнення помилок. Також ПЛР дозволяє визначити вихідне кількість копій ДНК збудника в клінічній пробі, що допомагає виявляти періоди загострень захворювань і вживати своєчасних заходів для лікування пацієнта.

На сьогоднішній день існує велика кількість методів фіксації ампліфікації в реальному часі. Найбільш часто використовуються різні методики, які застосовують співвідносяться з амплікон флуорогенние зонди, інтенсивність випромінювання яких змінюється в залежності від накопичення амплікона і записується в реальному часі за допомогою спеціального приладу, іменованого ампліфікатором з оптичним модулем. Це забезпечує високий рівень чутливості проведеного аналізу. При цьому продукт ПЛР може бути виявлений поряд з величезною кількістю побічних продуктів, в той час, коли при використанні електрофорезу він в частих випадках не помічається.

При ПЛР в реальному часі використовують позитивні, контрольні і негативні зразки. Так, позитивні і негативні зразки при проведенні дослідження аналізуються як окремі проби, контрольний зразок при цьому вноситься в кожну таку пробу і проходить всі етапи аналізу.

На сьогоднішній день існує велика кількість приладів для проведення полімеразної ланцюгової реакції. До них можна віднести Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid або Roche. Кожен з них має переваги і недоліки

Слід зазначити, що ПЛР - метод діагностики, який використовується у великих наукових, дослідницьких та діагностичних центрах різних країн світу, оскільки дає можливість проводити миттєву інтерпретацію отриманих результатів.